Mariana, moça simples do interior de Minas Gerais, chega ao Rio de Janeiro à procura de um noivo carioca, que lhe dera um endereço em Copacabana. Seu nome é José da Silva. A moça hospeda-se na casa de uma tia, Dona Adalgisa, mãe de Baiano e de Elisa, moradores do subúrbio carioca. Sabendo dos problemas da prima, e após se certificarem de que o endereço dado pelo rapaz não existe, os parentes tentam encontrá-lo. Ao mesmo tempo, Mariana começa a vivenciar outro problema: está grávida. Convictos de que o rapaz se aproveitou da ingenuidade da moça, os primos, mais Eduardo, colega de Baiano que se apaixona por Mariana ao vê-la na rodoviária, onde fora buscá-la, empreendem tenaz busca por todo o Rio de Janeiro ao possível pai da criança. Seria o mesmo que procurar uma agulha no palheiro.

A produção da nova cópia digital de Agulha no Palheiro foi feita pela Cinemateca Brasileira a partir das matrizes em película produzidas na década de 1970. A imagem foi escaneada em resolução 2K e passou por tratamentos digitais para diminuir as marcas da deterioração física dos originais.